NIM : J1C108036
Prodi : BIOLOGI
Glycine N-methyltransferase is an Example of Fungsional Diversity
Sitokrom P-4501A1 (CYP1A1) baru ini diidentifikasi sebagai N-methyltransferase glisin (GNMT). Peran GNMT sebagai 4 S PAH-mengikat protein menengahi induksi sitokrom P-4501A1 telah diselidiki lebih lanjut. Beberapa klon positif dipilih oleh reverse transcription-polymerase chain reaction dan diuji untuk ekspresi protein rekombinan. Barat noda analisis menunjukkan ekspresi signifikan tingkat dari 4 S protein dalam transfected CHO ke sel (CHO-GNMT). Tidak ada pesan reseptor Ah atau protein yang terdeteksi dalam CHO CHO-neo, atau GNMT CHO-sel. Penelitian ini tegas menetapkan bahwa adalah GNMT PAH-binding protein yang dapat menengahi induksi CYP1A1 oleh PAHs seperti B [a] P melalui reseptor-independen Ah jalur.
Polycyclic aromatic hydrocarbon seperti B [a] P1, 3 methylcholanthrene, dan TCDD adalah polusi lingkungan yang mendatangkan berbagai macam racun, teratogenic, dan karsinogenik. Selain itu , beberapa di antaranya dapat berinteraksi dengan DNA, sehingga berpotensi mengaktifkan protooncogenes atau menonaktifkan gen supresor tumor.
GNMT pertama kali ditemukan dalam ekstrak hati guinea babi dan didalilkan untuk terlibat dalam oksidasi metil karbon dari metionin, meskipun jalur ini dihitung hanya 20% dari total metil metabolisme metionin. Dalam sebuah studi Cook danWagner , GNMT ditunjukkan bertindak sebagai folatebinding protein dalam sitosol hati tikus. Tikus GNMT homotetramer terdiri dari 33-kDa subunit tersedia media mengikat independen untuk S-adenosylmethionine, glisin, dan folat dan juga untuk B [a] P (34). Bentuk enzimatik GNMT, yaitu homotetramer, dan monomer tidak dapat berfungsi baik enzimatik atau sebagai B [a] P pengikat.
MATERIALS AND METHODS
Bahan kimia- medium kultur jaringan, sebagai berikut serum janin sapi, gentamycin, geneticin (G418), dan Lipofectin. Sumber bahan lain [a-32P] dATP dari ICN biokimia (Irvine, CA);[3H]B[a]P (60 Ci / mmol) dari Amersham Corp; [3H] TCDD (41 Ci / mmol) dari Chem-Syn Science Labs (Lenexa, KS); Immobilon P dari Millipore (Bedford, MA); S & S mentransfer membran dari Schleicher & Schuell (Keene, NH); BM Chemiluminescence blotting Barat kit dari Biochemica Boehringer Mannheim Corp (Indianapolis, IN); Tris, TEMED,Tween 20, B [a] P, B [e] P, 3-methylcholanthrene, TCDD, Isositrat dehidrogenase, nikotinamida, ethoxyresorufin, dan resorufin dari Sigma.
HASIL
Sel CHO dipilih sebagian sebagai target untuk transformasi karena kurangnya ekspresi gen endogen dan GNMT efisiensi transfection dengan pMAMneo / GNMT menggunakan Lipofectin teknik. 35 neomisin-klon resisten secara acak dipilih, terisolasi, dan tumbuh menjadi budaya massa untuk karakterisasi lebih lanjut. Penyaringan awal dilakukan oleh RT-PCR analisis dari klon G418-tahan untuk 4 S PAH-binding protein dan b-aktin ekspresi gen.
Pada Sel CHO-GNMT-Untuk menentukan secara langsung jika sel GNMT CHO-GNMT memproduksi protein, selular total protein denaturating dianalisis dengan elektroforesis gel, dan protein yang ditransfer ke nitroselulosa membran dan menggali afinitas-disucikan dengan antibodi poliklonal untuk GNMT. CHO-GNMT sel mengekspresikan tingkat signifikan bila dibandingkan dengan GNMT tingkat yang tidak terdeteksi ada pada jalur d atau CHOneo (jalur c). Kepadatan sukrosa Analisis Gradient B [a] P dan TCDD Binding Kegiatan-Spesifik B [a] P dan mengikat TCDD kegiatan ditentukan dalam berbagai sel CHO. Spesifik kegiatan mengikat TCDD ditetapkan dalam cytosolic ekstrak dari kontrol positif, HEPA-1 sel hepatoma. Pada dasarnya tidak ada kegiatan mengikat TCDD diamati di ekstrak baik dari CHO-GNMT (jalur 2), CHO-neo (data tidak ditampilkan), atau CHO (data tidak ditampilkan) sel.
Pembentukan reseptor XRE-Ah juga dibuktikan dengan ekstrak nuklir dibuat dari HEPA-1 sel yang telah diperlakukan in vivo dengan TCDD (jalur 4). Sekali lagi, tidak kompleks seperti diamati dengan diobati TCDD-CHO-GNMT ekstrak nuklir (jalur 8). Hasil ini jelas menunjukkan bahwa sel CHO-kurangnya GNMT setiap endogen Ah ekspresi reseptor dan bahwa PAH-induced ekspresi CYP1A1 terjadi melalui sebuah Ah receptorin dependent jalur.
DISCUSSION
The 4 S PAH-binding protein diidentifikasi sebagai GNMT pada dasar beberapa kriteria, termasuk pemurnian, pengurutan, immunoprecipitation dari PAH aktivitas mengikat antibodi poliklonal untuk GNMT, dan copurification dari dua protein dalam berbagai sel dan jaringan. Penelitian ini dirancang untuk memperkenalkan GNMT gen ke dalam sel yang tidak memiliki kemampuan untuk mengekspresikan protein ini serta reseptor Ah. Sel-sel kemudian akan menyediakan model biologis yang cocok untuk menguji induksi oleh PAHs seperti B [a] P dan 3-methylcholanthrene. Hasil studi ini memberikan informasi langsung peran fungsional sebagai GNMT PAH-binding protein yang dapat menengahi induksi CYP1A1.
GNMT itu diperkenalkan secara stabil ke CHO (D422) sel, yang tidak memiliki ekspresi endogen protein serta Ah reseptor, melalui plasmid yang berisi virus Moloney ulangi terminal lama sebagai promotor dan neomisin menunjukkan perlawanan sebagai pilihan penanda. Jika hipotesis GNMT, yaitu 4 S PAH-mengikat protein, sebagai mediator dari PAH-induksi ekspresi CYP1A1 berlaku, sistem sekarang harus menanggapi B [a] P dalam yang sesuai cara.
GNMT juga telah diusulkan sebagai modulater ekspresi gen oleh metilasi dari substrat yang belum belum teridentifikasi . Bisa dibayangkan bahwa GNMT dapat bertindak tidak langsung dalam modulasi B [a] P-induksi ekspresi CYP1A1 methylating diketahui oleh substrat yang dapat mempengaruhi gen, karena hypermethylation telah ditunjukkan oleh banyak laboratorium untuk mempengaruhi aktivitas gen
Sebagai kesimpulan telah ditunjukkan bahwa GNMT adalah PAH-binding protein yang menjadi perantara induksi CYP1A1 oleh Ah reseptor-jalur independen. Penyelidikan tambahan diperlukan untuk lebih memahami faktor-faktor yang mengatur GNMT jumlah dan karena itu dimerik mengendalikan ekspresi dari CYP1A1.
.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar